一次PCR荧光法检测实验耗时多久？
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一次PCR荧光法检测实验耗时多久？
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发表于 2024-9-2 10:52
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一般核酸检测在3-6小时出结果，那么除去样本运输时间，纯粹的实验时间需要多久呢？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/520516690
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发表于 2024-9-2 10:59
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qPCR实验时使用透明管，得到的实验结果荧光信号值比较低，曲线被压得很低，坐标轴也不能自适应曲线，显示如下图。
而正常情况如下图，纵坐标的范围是可以随着曲线最大荧光信号值而变化的，并可获得一条漂亮的S曲线。
更换成白管后，问题就迎刃而解了。那么，问题来了，为何做qPCR实验时一定要用白管呢？荧光信号值与哪些因素有关呢？我们一起来学习一下吧～
1
白管PK透明管
PCR管/板常见的有白色和透明两种。在传统PCR实验中，两者在使用效果上没有太大差异，相比较透明管更为方便，因为实验者更容易看清楚试剂加上与否。但在荧光定量PCR实验中，白管的优势就凸显出来了。
优势一：白管管壁支持一致的信号反射，提高qPCR结果的一致性。
qPCR实验的核心数据是Ct值，而荧光信号是Ct值计算的数据来源，所以管内的荧光能否完好地传递至顶部的检测器是至关重要的。
如下图是三种不同透明度的管子，因为透明管四周均是透明的，对于底部试剂激发出来的荧光会散向四面八方，管内的荧光信号只有少量能到达管顶部，最终只有少量信号进入检测器，且管间荧光信号不一致。
图1 白管和透明管内部荧光信号路线图
然而，如图1所示，与其他管材相比，白管管壁不透明，几乎没有信号丢失，且隔绝了样品台污染的荧光信号干扰，减少了相同样本孔间差异。
优势二：白管支持最大限度的信号传输，改进对低拷贝数样本的检测，提高灵敏度。
图2 白管和透明管检测信号对比图
从图2中可以看出，同样试剂量的情况下，到达检测器的信号强度，使用白管明显高于透明管。因此相比于透明管，使用白管可明显提高检测器检测到的信号强度，提高qPCR数据的灵敏度。
优势三：支持更小体系扩增，节约实验成本。
正因为白管有着高灵敏度的特性，使用白管可以采用小体积反应，从而可减少实验试剂量，大大节省成本～
图3 白管扩增结果展示图
国际一线品牌也同样证实白管更适合实时荧光定量实验的结论。
如上图，qPCR使用透明和白色耗材的结果比较：
（A）与透明孔相比，白色孔Ct值更低（灵敏度更高）
（B）白色孔在技术重复中也表现出更高的一致性
在设置实时PCR或qPCR的反应时，与透明耗材相比，更推荐使用白色耗材，以实现灵敏和准确的荧光检测。
Sarstedt
那么荧光定量PCR仪需要采用什么技术才能满足使用白管呢?我们来看一下国际主流品牌的定量PCR仪产品，一探究竟吧～
我们来看一下赛默飞的高端系列Q5和Q7，他们用的是CCD顶部检测的技术方案，再来看一下罗氏的旗舰产品LG480，我们可以看到，他们用的也是CCD顶部检测技术。
顶部CCD检测技术光学部件固定，稳定性好，故障率低，对荧光信号的接收和处理能力强，是定量PCR仪检测技术的大势所趋。
综上所述，在进行qPCR实验时，使用白管和顶部检测技术的qPCR仪，可获得更佳实验结果。
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发表于 2024-9-2 11:05
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一般上机扩增时间是1.5h左右，加上上样时间(应该一般96孔，因为不可能说一次就做一个样本的检测)大概0.5h，所以全程应该2－3h。
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发表于 2024-9-2 11:10
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最快（急诊，夜班标本少时用）：使用快速检测采样管，不需要提取，使用快速检测PCR仪，扩增40分。一次做一个标本，算加样和结果分析时间，总实验时间45分。
正常时间：每次提取96个标本，提取上样20-30分，提取仪运行20-30分，扩增上样5-10分，普通PCR仪扩增90-120分，结果分析10分。一批标本需要2.5-3.5小时。
我们是一小时送一批标本，标本少时会等一等攒96个做一批，标本多时一批做不下就会有标本在下一批做。标本比较多时接收标本花费时间也不可忽略
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发表于 2024-9-2 11:19
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以Takara RT试剂盒和定量试剂盒为例，从你rna反转到出结果：
1、配制去gDNA 试剂，于室温或者42度2-5 min（参考说明书）；
2、 配制RT试剂 加入去gDNA后的试剂中，37/42度 15 min，85度5 s，然后完成RT；
1、2两步花费半个小时 足以，然后对cDNA进稀释，用于配制qPCR试剂，上机pcr，参考说明书推荐体系和扩增分步操作，一般上机需要65min左右就结束，所以硬性实验（机器跑或者酶处理）就需要95min左右，中间加样，试剂配制所用时间，根据你的样本和熟练程度决定咯～
其他方面，如果你从获得样本，到最终出结果，不是这样简单的一个流程，前期还需要检测定量引物是否特异性、Tm温度摸索、cDNA稀释浓度等等，也需要花时间。
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发表于 2024-9-2 11:20
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2个小时左右吧。
纯粹的上机PCR的时间大概一个多小时左右，前面提取核酸和配制反应体系还需要一点时间，总的来说两个多小时可以走完。
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